Im 3. Schritt wird das Fructose-6-phosphat durch Anhängen einer weiteren Phosphatgruppe noch weiter aktiviert; die innere Energie des Moleküls steigt wieder um ca. 16 kJ/mol. Es bildet sich Fructose-1,6-bisphosphat.

Das katalysierende Enzym dieses 3. Schritts heißt Phosphofructokinase und kann durch ADP aktiviert sowie durch ATP und Fettsäuren (!) gehemmt werden. Der Reaktionsschritt ist genau wie der erste irreversibel, da das chemische Gleichgewicht weit auf der rechten Seite liegt.

Warum ist dieser Schritt notwendig?

Diese Frage ist bereits beantwortet worden. Die Glucose wurde nun durch zwei Phosphatgruppen aktiviert und kann jetzt gespalten werden.